0371-60972711
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2017-07-21 15:21:09 來源： 點擊：
濱海河口區受潮汐作用影響，水體多為咸水或半咸水，經濟發展導致水體富營養化現象普遍存在.近年來，生態浮床技術在水生態修復中得到廣泛應用，生態浮床利用植物根系的吸附和吸收作用，能夠有效地降低水體中污染物濃度，同時，浮床植物根系能夠附著微生物，利用微生物的降解功能進一步提高生態浮床對水體的凈化能力.有研究表明，在淡水環境中，植物根系分泌的有機酸、蛋白質等物質能夠促進微生物的生長，根系泌氧為植物內生菌和根際微生物提供氧氣;同時，微生物降解產生的小分子有機物、無機物等可以被植物吸收利用，植物和微生物產生協同增效作用，進一步強化生態浮床對水質的凈化效果;然而目前將生態浮床應用于凈化濱海地區鹽堿水體的研究較少.受鹽堿脅迫的影響，一方面，植物的生長受到限制，光合作用強度降低，根系活力下降，生態浮床對水體的凈化效果尚不清楚;另一方面，在鹽堿環境中，植物和微生物在凈化富營養化水體中能否產生與淡水環境中相同的協同增效作用有待進一步探究.本研究選用鹽生植物堿蓬(Suaeda salsa)作為浮床植物，在浮床上安裝附著有微生物的人工介質，構建組合型浮床;通過對照實驗，探究該組合型浮床對富營養化微鹽堿水體的凈化效果，對植物和微生物在水質凈化過程中的協同增效作用進行探討，并對浮床植物生長狀況和微生物特征進行分析，以期為組合型浮床在微鹽堿水體生態修復中的應用提供理論支撐.1 材料與方法1.1 實驗裝置
實驗在4個相同的反應器中進行，反應器長寬高為80 cm×20 cm×50 cm，反應區長70 cm，有效水深30 cm，反應器由進水系統、浮床系統、曝氣系統和出水系統4部分組成，如圖 1所示.其中，浮床系統由浮床植物、浮板和懸掛在浮板下的人工介質3部分組成.實驗選取濱海鹽生植物堿蓬作為浮床植物，選用聚乙烯泡沫板為浮板(50 cm×19 cm×2.5 cm)，浮板上帶有直徑為5 cm的植物種植孔，可以將植物固定在種植孔中;浮板下懸掛人工介質(醛化纖維)，每組懸掛六串，每串長25 cm;在反應區底部安裝有曝氣系統.
圖 1 組合型浮床示意
1.2 實驗材料
實驗用水為自行配置的模擬水，各項指標均參考青島市李村河河口區水質狀況，如表 1，水體鹽度為5‰~7‰，pH值為8.5~9.0.
表 1 實驗用水水質指標
實驗用植物堿蓬采自青島市李村河河口區.實驗開始前，先將堿蓬植株在Hoagland營養液中水培15 d，待長出新根后，選取長勢良好且株高和根長相近的植株作為浮床植物，并清洗根部.稱取200 g堿蓬植物種植于浮床的種植孔中，浮床植物平均株高19 cm，平均根長4.5 cm，平均種植密度500株·m-2.浮床所用人工介質在掛膜前進行消毒，選對植物具有抗病蟲害、促進植物生長的枯草桿菌作為菌劑，采用悶曝法進行掛膜，掛膜3 d后，人工介質上出現淡黃色黏稠狀生物膜后，安裝于浮床上進行實驗.
1.3 實驗設計
本實驗在編號為A、B、C、D的4個相同的反應器中進行，分別安裝空白浮床A、植物浮床B、微生物浮床C、植物+微生物組合型浮床D. 4組實驗進行統一供水，實驗用水通過計量泵連續進入配水池，再通過布水隔板上的布水孔均勻地進入反應區，并從出水口(閥門2) 連續出水;調節進水流速，控制力停留時間(HRT)為4 d. 4組實驗均連續曝氣，調節曝氣量為0.8 L·min-1.實驗從2016年5月26日(0 d)開始，至2016年6月19日(24 d)結束，實驗期間各組水溫為15~18℃.采光良好，室內氣溫為18~25℃.
1.4 監測項目和測試方法
實驗開始后，每天上午08:00從反應器出水口采集水樣，迅速在實驗室內進行分析，測定水樣中的鹽度、pH、氨氮、硝態氮、總氮、總磷的濃度和高錳酸鹽指數.實驗結束后，測定各組水體中的細菌總量.分別在各組實驗開始時和結束時，測量每組堿蓬的鮮重、株高和根長.
水質指標監測按文獻方法測定.其中，水體中的氨氮采用納氏試劑分光光度法;硝態氮采用氨基磺酸紫外分光光度法;總氮采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法;總磷采用過硫酸鉀消解-鉬銻抗分光光度法;高錳酸鹽指數的測定采用高錳酸鉀法;水體中細菌總量采用平板涂布法.
1.5 高通量測序分析
在實驗進行24 d時從反應器C、D中采集菌體樣品，并采用CTAB對樣本的基因組DNA進行提取，檢測DNA的純度和濃度，進行PCR擴增和產物純化(委托北京諾禾致源公司完成).使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250對細菌16S rDNA V4區進行測序(委托北京諾禾致源公司完成).
利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)對所有樣品的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，同時會選取OTUs的代表性序列，依據其算法原則，篩選的是OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列.
選取每個樣品在門水平(Phylum)上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度分布圖.對不同樣品在97%一致性閾值下的Alpha Diversity分析指數進行統計.
1.6 數據分析
為探究組合型浮床在凈化富營養化微鹽堿水體的過程中植物單元和微生物單元的作用，本研究在測定水體中各項污染物指標的基礎上，用c/c0來表征出水污染物濃度變化，其中，c為出水污染物濃度(mg·L-1)，c0為進水污染物濃度(mg·L-1);分別計算各污染物的去除率η1，其他作用(曝氣、光照等)去除率η2，植物單元去除率η3，微生物單元去除率η4，增效作用去除率η5，計算方法為：
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
對各組實驗出水中污染物的各項指標進行初步分析表明，實驗進行10 d后出水中各污染物濃度基本趨于穩定，因此選取第0、2、4、6、8、10、12、18、24 d的監測數據進行分析，并計算10~24 d的出水平均濃度.數據分析采用統計軟件SPSS 19.0，通過單因素方差分析(ANOVA)比較各項測試指標在實驗條件下的顯著性差異，并在P=0.05水平下進行Tukey檢驗;采用主成分分析法對反應過程中各因素的主成分進行分析.數據作圖采用Origin 8.5.
2 結果與討論2.1 組合型浮床對氮的凈化效果2.1.1 不同組合浮床對氮的凈化效果
4組浮床進出水中氨氮、硝態氮、總氮的濃度變化如圖 2(a)~2(c)所示.實驗初期，各組實驗出水中氨氮、總氮濃度均隨時間的延長顯著降低(P < 0.05)，10 d后4組實驗出水中氨氮、總氮濃度逐漸趨于穩定;4組實驗出水中硝態氮濃度出現不同的變化趨勢，在0~4 d，水體中硝態氮濃度逐漸升高，其中添加有微生物的C組和D組實驗出水中硝態氮濃度顯著高于進水(P < 0.05);在4~12 d，4組實驗出水中硝態氮濃度迅速降低，并趨于穩定.待出水穩定后，D組實驗出水中氨氮、硝態氮、總氮平均濃度最低，出水平均濃度為0.83、0.91和1.82 mg·L-1，均達到地表Ⅴ類水質量標準.
圖 2 不同組合浮床對氮的凈化效果
2.1.2 植物和微生物對氮的凈化作用
水體中的氮主要由氨氮、硝態氮、亞硝態氮和有機氮組成.水體中氮的去除機制主要有物理吸附作用、植物吸收和微生物降解作用.按照1.6節中污染物去除率的計算方法，得到組合型浮床凈化氨氮、硝態氮和總氮的過程中其他作用去除率η2、植物單元去除率η3和微生物單元去除率η4，如圖 2(d)所示.浮床D對氨氮的去除率η1為77.8%，其中η4(38.6%)>η2(24.9%)>η3(16.5%)，表明微生物在組合型浮床去除水體中氨氮的過程中發揮著主要作用.在有氧環境中，植物可以直接吸收利用氨氮合成多種氨基酸，而大部分的氨氮則主要通過硝化細菌的硝化作用轉化為硝態氮和亞硝態氮，一部分被植物吸收利用，一部分被反硝化細菌轉化為氮氣排出水體.同時，在堿性環境下，一部分游離態的NH4+轉化為分子態的NH3和NH3·H2O，在連續曝氣作用下，通過揮發作用逐漸被去除.
水體中硝態氮的去除方式主要有兩種，一是被植物根系吸收利用，作為植物生長所需營養，進入植物體內被轉化為有機氮;二是在缺氧或厭氧環境中通過水體中反硝化細菌的硝化作用，轉化為亞硝態氮，進而轉化為N2進入到空氣中.由圖 2(b)可知，實驗開始時，在添加有微生物的C組和D組實驗出水中硝態氮濃度顯著高于進水(P < 0.05)，主要是由于在實驗初期植物和微生物的生長狀態尚不穩定，植物對硝態氮的吸收速率小于微生物的硝化作用速率，水體中的硝態氮不斷積累;隨著實驗的進行，一方面，浮床植物生長狀態趨于穩定，植物對硝態氮的吸收速率加快，硝態氮濃度逐漸降低;另一方面，人工介質表面生物膜厚度增加，在生物膜內部形成厭氧環境，有利于反硝化細菌的生N2排出水體.在硝態氮的凈化過程中，微生物單元去除率η4>植物單元去除率η3>其他作用去除率η2，表明微生物在組合型浮床去除水體中硝態氮的過程中發揮著主要作用.
由圖 2(c)和2(d)可知，實驗進行10 d后，4組實驗出水中總氮濃度趨于穩定，浮床D實驗出水中總氮平均濃度最低，平均去除率為70.5%，明顯高于浮床B對總氮的平均去除率(32.5%);其中植物單元和微生物單元對總氮的去除率分別為20.6%和37.7%，大于其他作用去除率，表明植物的吸收作用和微生物的硝化-反硝化作用是去除總氮的兩個主要途徑，且微生物的作用占主要地位.在本實驗后期，植物根系脫落的腐殖質進入水體，水體中的有機氮濃度增加，出水中總氮濃度達到動態平衡.在傳統的植物浮床系統中，植物的生長速率和吸收能力限制了其對污染物的凈化能力，而在組合型浮床中，微生物的硝化-反硝化作用極大地提高了對水體中氮的去除能力.
2.1.3 組合型浮床的增效作用
通過計算浮床D凈化氨氮、硝態氮、總氮的增效作用去除率η5，探究微鹽堿水體中堿蓬植物與微生物凈化水體的協同增效作用.由圖 2(d)可知，與淡水中植物和微生物的增效作用不同，浮床D對氨氮的去除率η1小于η2、η3、η4之和，表明在微鹽堿環境中堿蓬植物和枯草桿菌在去除氨氮過程中沒有產生協同增效作用，而浮床D凈化硝態氮和總氮的增效作用去除率分別為12.2%、0.3%，表明浮床D對硝態氮的去除產生了一定的增效作用，而對總氮的去除沒有產生明顯的增效作用.
在微鹽堿水體中，植物的生長受到抑制，根系活力下降，光合作用速率降低，植物細胞通過無機離子和有機溶質調節細胞內外滲透壓.有研究表明，鹽度能夠影響根系分泌物的種類和數量，使植物根際微環境發生變化，從而對微生物活性和種類產生影響.王鄭等采用水生植物與人工填料構建的組合型浮床對某農家樂污水進行凈化實驗，研究結果表明，組合型浮床對氨氮和總氮的去除效率為88.67%、73.88%，進一步的計算結果表明，組合型浮床去除農家樂污水中氨氮和總氮的增效作用去除率均達到10%以上.與此研究結果不同，在本研究中，受鹽堿脅迫的影響，植物+微生物組合型浮床對氨氮、總氮沒有產生與淡水環境中相同的協同增效作用.
2.2 組合型浮床對磷的凈化效果2.2.1 不同組合浮床對磷的凈化效果
不同組合型浮床對總磷的凈化效果如圖 3.從中可知，A組實驗出水中總磷濃度沒有出現顯著差異(P < 0.05).在B組和D組實驗中，實驗進行的0~4 d，總磷濃度下降緩慢;在4~10 d，總磷濃度顯著下降(P < 0.05)，10 d后出水總磷濃度基本趨于穩定(P < 0.05);在C組中，實驗進行10 d后，出水總磷濃度基本趨于穩定(P < 0.05)，可能是實驗前期植物生長狀態尚未穩定，速率較慢，10 d后植物適應了相應的生長環境，對磷的吸收速率增加并趨于穩定. 4組實驗出水總磷平均濃度大小順序為：A組>B組>C組>D組，表明植物+微生物組合型浮床對水體中總磷的去除效果均高于其他3組.
圖 3 不同組合浮床對總磷的凈化效果
2.2.2 植物和微生物對磷的凈化作用
按照1.6節中的公式分別計算4組浮床對總磷的去除率和各單元的去除率.浮床B和浮床D對總磷的平均去除率分別為14.3%和34.7%，其中η4(21.6%)>η3(13.6%)>η2(0.7%)，表明植物+微生物組合浮床型浮床對總磷的去除率顯著高于植物浮床，且微生物在組合型浮床去除水體中磷的過程中發揮著主要作用.一方面，磷元素是微生物生長繁殖的必須元素，微生物對磷的富集和降解作用能夠有效降低水體中總磷濃度;另一方面，人工介質對分子態和顆粒態的磷有一定的吸附作用.其他作用去除率η2幾乎為0，表明其他作用包括曝氣、光照等對水體中總磷濃度幾乎沒有影響.然而，植物+微生物組合型浮床對總磷的增效作用去除率為-1.3%，表明植物+微生物組合型浮床對水體中總磷的去除沒有產生協同增效作用.
對4組實驗出水中的總磷檢測結果表明，水體中磷的去除機制包括植物吸收、微生物富集和降解作用，而植物對磷的吸收作用受植物吸收能力的限制，對水體中總磷的去除率不高，而在植物和微生物聯合作用下，能夠有效降低水體中總磷濃度，且微生物的富集作用和人工介質的吸附作用占主要地位.然而，受植物吸收能力和微生物對磷的降解能力的限制，組合型浮床對總磷的去除效果有限，這與楊林燕等的研究結果相似.選擇具有較強吸附能力的人工介質或填料以及選用具有較強富集效應的聚磷菌等方法能夠進一步提高組合型浮床對總磷的去除效果.
2.3 組合型浮床對高錳酸鹽指數的凈化效果2.3.1 不同組合浮床對高錳酸鹽指數的凈化效果
對4組實驗進出水中高錳酸鹽指數進行監測，高錳酸鹽指數變化如圖 4.實驗開始后，A組和B組出水中高錳酸鹽指數均出現小幅降低，在實驗進行4 d后即趨于穩定(P < 0.05);在添加有微生物的C組和D組中，從實驗開始到第8 d，出水中高錳酸鹽指數顯著降低(P < 0.05);在實驗進行8 d后實驗出水中高錳酸鹽指數之間均沒有顯著性差異(P < 0.05)，4組實驗出水中高錳酸鹽指數平均值大小順序為：A組>B組>C組>D組，表明植物+微生物組合型浮床對高錳酸鹽指數的去除效果最佳.
圖 4 不同組合浮床對高錳酸鹽指數的凈化效果
2.3.2 植物和微生物對高錳酸鹽指數的凈化作用
水體中過高濃度的有機物是導致水體惡臭的主要原因，對水體中有機污染物的去除機制主要有微生物的降解、植物根系的截留和人工介質或填料的吸附作用，其中微生物的降解作用占主要地位.與本研究結果相似，通過計算得到組合型浮床在去除高錳酸鹽指數過程中各單元的去除效率，其中，η4(44.5%)>η3(17%)>η2(11.2%)，微生物對高錳酸鹽指數的去除作用明顯大于植物，表明微生物的降解作用在去除高錳酸鹽指數的過程中發揮著主要作用.水體中的有機污染物能夠為微生物提供碳源、氮源、無機鹽等營養物質，為微生物的生長和繁殖提供能量來源.
在本研究中，浮床D對高錳酸鹽指數的平均去除效率為70.8%，明顯高于浮床B(28.2%)，其中增效作用去除率為-1.9%，表明在微鹽堿環境中，堿蓬植物和枯草桿菌之間沒有產生協同增效作用，較高的去除率是植物和微生物聯合作用的結果.
2.4 浮床植物的生長狀況
植物的生長狀態是反映水質改善的一個關鍵因素.植物可以通過根部吸收、吸附等作用去除水體中的營養鹽.
實驗初期，浮床B和浮床D中的堿蓬植物生長良好，根部長出新根，并有新芽長出，植株高度明顯增加，植株頂部有新芽長出，實驗進行6 d左右時，浮床D中植物根部有微生物黏膜形成.實驗開始和結束時，B組和D組實驗中堿蓬植物的各項生長指標如表 2. B組和D組中的植物鮮重、株高和根長均有所增加，表明在增加曝氣、人工介質等條件下，鹽生植物堿蓬可以在浮床上正常生長. D組實驗中植物各項生長指標的增加量均高于B組，這表明植物+微生物組合型浮床比僅有植物的浮床更適合浮床植物的生長，這可能與D組中的微生物有關.一方面，微生物通過降解作用，將水體中的污染物降解為可直接被植物吸收利用的小分子物質和微量元素，并促進植物的生長;另一方面，微生物可以通過降低植物病原體對植物的毒害作用，提高植物的生存能力.
表 2 實驗前后浮床B、D中堿蓬生長指標
2.5 浮床微生物特征
實驗結束時對4組實驗進出水中細菌總數進行檢測結果表明，C組和D組實驗出水中細菌總數顯著高于A組和B組.因此，在97%相似水平下從C組、D組中提取微生物的OTUs代表序列，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析，獲得分類學信息，并得出門水平的細菌群落結構相對豐度，如圖 5所示.結果顯示，浮床微生物主要由10個門類組成，分別是Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Cyanobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes、Gracilibacteria、Hydrogenedentes，兩組實驗中優勢菌種均為Proteobacteria.
圖 5 門水平上微生物群落相對豐度分布
對不同樣品在97%一致性閾值下的Alpha Diversity分析指數進行統計分析，結果如表 3. C組、D組樣品文庫覆蓋率均在99.9%以上，表明本研究樣品中的大多數微生物種類都被檢測到了.由樣品菌群豐富度指數(chao1指數和ACE指數)可知，D組浮床中微生物的豐度高于C組，由樣品多樣性指數(Shannon指數和Simpson指數)可知，D組浮床中微生物的多樣性也高于C組.這些研究結果表明，與僅安裝人工介質的浮床C相比，浮床D中微生物具有更高的豐富度和多樣性，進而說明在浮床上種植堿蓬植物有利于微生物的生長和繁殖，這與浮床D具有較高的污染物去除率的結果相一致.
表 3 浮床微生物群落多樣性
浮床植物根系可以為微生物提供附著位點，根系泌氧為微生物的新陳代謝提供氧氣，植物根際為微生物提供適宜生長和繁殖的微環境.一方面，浮床C和浮床D上安裝的人工介質為微生物提供了充足的附著位點，有利于微生物的生長和繁殖;另一方面，人工介質可以吸附氮、磷和小分子有機物等，這些物質又可以為微生物提供營養，進一步促進了微生物的生長和繁殖.
為了探究不同變量之間的相互作用關系，對植株鮮重增量、細菌總量及水體中各污染物的去除率進行主成分分析(PCA)，提取得到第1、第2主成分，如圖 6.其中，第1主成分主要反映了細菌總量和水體各污染物去除率的關系，第2主成分主要反映了植物鮮重增量與水體中各污染物去除率之間的影響.分析結果表明，浮床植物的營養吸收作用和微生物的降解作用在水體凈化過程中發揮著重要作用，其中，微生物在植物+微生物組合型浮床凈化微鹽堿水體中發揮著主要作用.
圖 6 組合型浮床實驗中各變量PCA分析
綜上所述，組合型浮床對富營養化微鹽堿水體具有較好的凈化效率，一方面鹽生植物堿蓬對微鹽堿環境具有一定的耐受能力，通過增加曝氣等條件，堿蓬植物能夠在微鹽堿水體中生長，并通過吸收和吸附作用去除微鹽堿水體中的營養鹽;另一方面，人工介質中的微生物通過富集和降解作用，極大地降低了微鹽堿水體中污染物濃度.高通量測序結果表明，組合型浮床有利于微生物的生長和繁殖，從而強化了組合型浮床對營養鹽的去除效果.通過比較植物單元和微生物單元對污染物的去除率，表明微生物的降解作用在植物+微生物組合型浮床凈化富營養化微鹽堿水體的過程中發揮主要作用.與本研究結果相似，王國芳等探究了組合型浮床中的水生植物單元、水生動物單元、微生物單元對污染物的去除率，結果表明，人工介質附著的微生物是氮磷等污染物的凈化主體，其中微生物單元對總氮、總磷、高錳酸鹽指數的去除率分別為48.5%、46.7%、49.9%，均高于水生植物和水生動物單元.
植物根系分泌的低分子量有機酸、小分子量蛋白質等物質能夠改善植物根部微環境，并對微生物的生長和繁殖產生影響.不同植物根系分泌物的種類和數量不同.劉雯等研究了茭白和美人蕉植物根系分泌物與脫氮之間的關系，結果表明，美人蕉根系能夠比茭白分泌更多的溶解性有機碳(DOC)，這些可溶性的有機碳可以為污水中微生物提供碳源，有利于氮的反硝化.然而，植物根系分泌物的種類和數量隨生存環境的變化而變化，在鹽堿環境中，植物分泌的有機酸種類發生了變化，小分子蛋白質活性降低，這些都對微生物的生長和繁殖產生影響. Rocha等研究了鹽度對蘆葦根系分泌低分子量有機酸的影響，在鹽環境中，蘆葦根系檸檬酸含量增加，能夠對根際微生物的生長和繁殖產生影響.在本研究中，受鹽堿脅迫的影響，植物和微生物之間沒有出現明顯的協同增效作用.在實際應用中可進一步篩選不同的鹽生植物和微生物進行搭配，以提高組合型浮床對微鹽堿水體的凈化效果。
3 結論
(1) 植物+微生物組合型浮床對富營養化微鹽堿水體有較好的凈化效果.浮床系統運行穩定后，組合型浮床對水體中的總氮、總磷、高錳酸鹽指數的平均去除率分別為70.5%、34.7%、70.7%，顯著高于只有堿蓬的植物浮床.
(2) 在微鹽堿環境中，植物+微生物浮床對去除硝態氮、總氮增效作用去除率為12.2%和0.3%，對去除氨氮、總磷、高錳酸鹽指數的增效作用去除率為負值，表明在微鹽堿環境下，鹽生植物和微生物之間的增效作用受到不同程度的抑制.
(3) 高通量測序分析結果表明，浮床微生物的優勢菌種為Proteobacteria，與僅安裝人工介質的微生物浮床相比，組合型浮床更有利于微生物的生長和繁殖.
(4) 主成分分析(PCA)結果表明，浮床植物的吸收作用和微生物的降解作用是水質凈化的主要機制，其中微生物對污染物的去除率高于植物.
(5) 該組合型浮床首次將鹽生植物與微生物進行組合，用于修復富營養化微鹽堿水體，有效提高了組合型浮床的凈化效率，同時具有較好的景觀效果，在微鹽堿水體生態修復中具有很好的應用價值.探究鹽堿脅迫下植物根系分泌物與微生物的相互作用機制并篩選不同鹽生植物+微生物組合有助于進一步提高浮床的凈化效果.
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